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脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與方法

 更新時(shí)間:2024-05-17 點(diǎn)擊量:305
  脂質(zhì)體作為體內(nèi)和體外輸送載體的工具,已經(jīng)研究的十分廣泛,中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA,借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)。帶正電的陽離子脂質(zhì)體,DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中,而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上,形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物,從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面,經(jīng)過內(nèi)吞被導(dǎo)入細(xì)胞。下面讓我們一起來看看脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與方法吧!
  脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作步驟
  進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前,請先規(guī)劃好實(shí)驗(yàn),一般細(xì)胞轉(zhuǎn)染需要24h-72h,所以要充分了解細(xì)胞生長速度,計(jì)算所需脂質(zhì)體和DNA的儲(chǔ)備量,并確認(rèn)準(zhǔn)備好所需試劑:Opti-MEM無血清培養(yǎng)基,Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑,以及DNA。
  1、細(xì)胞鋪板
  (1)一般會(huì)選擇復(fù)蘇細(xì)胞傳代3-4次,從解凍過程中恢復(fù)過來可以穩(wěn)定生長的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,傳代次數(shù)高(>30-40)時(shí),細(xì)胞的生長速度和形態(tài)會(huì)改變。
 ?。?)如果提總蛋白,一般選擇六孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染,因?yàn)檗D(zhuǎn)染的細(xì)胞提取蛋白的總量能達(dá)到200ug,一般夠做并且需要的DNA和Lipofectamine又相對比較少。
  (3)傳代條件取決于所用的細(xì)胞系。對于快速生長的細(xì)胞,倍增時(shí)間為16小時(shí)(如HEK293)。對于生長緩慢的細(xì)胞,倍增時(shí)間為36小時(shí)(如原代細(xì)胞)。
  (4)轉(zhuǎn)染當(dāng)天,將細(xì)胞鋪板。如果在轉(zhuǎn)染前一天或更早時(shí)間鋪板,轉(zhuǎn)染效率可能下降,如果是簡單細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染,可以直接在前一天晚上鋪板,第二天來轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí),細(xì)胞密度會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率,細(xì)胞密度保持在匯合率為70-90%(這個(gè)前提是轉(zhuǎn)染24h,如果轉(zhuǎn)染48h則需要匯合率為50-70%),細(xì)胞的鋪板和轉(zhuǎn)染也可同時(shí)進(jìn)行。
  2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
  吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基,用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。更換無血清培養(yǎng)基。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染制備液,用滅菌后的EP管制備。以六孔板為例,A液:用200μl Opti-MEM稀釋4μg質(zhì)粒;B液:用200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000,分別將A液、B液輕輕混勻,靜置5min,吸取B液加入至A液中,輕輕混勻,室溫靜置20min。加入轉(zhuǎn)染試劑到每個(gè)孔的培養(yǎng)基中,6h后,更換成完q培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)到24-48小時(shí)(不同的質(zhì)粒和脂質(zhì)體最佳搭配比例不同,轉(zhuǎn)染前,應(yīng)該摸一個(gè)最佳配比。質(zhì)粒:脂質(zhì)體=1:1,1:1.5,1:2,1:2.5,1:3,1:3.5的梯度比例來檢測最佳轉(zhuǎn)染比例,一般質(zhì)粒有帶熒光,可以通過觀察每組熒光強(qiáng)弱來判斷轉(zhuǎn)染效率)。以下為不同規(guī)格的培養(yǎng)板需要加DNA和lipo2000的量。
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